فهرست مطالب
تعیین روش سنتز سبز پلیمرهای (پلی گلیسرول سباکات، پلی پلیول سباسات، پلی گلیسیرین آزلاییک اسید) برای مهندسی پزشکی ترمیمی
علی جعفری1، سعید زارع2
1-دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران مرکز، گروه فنی مهندسی، مهندسی پزشکی، تهران، ایران
2- دانشگاه پیام نور، واحد شیراز، مرکز، گروه ریاضیات و کاربرد ها، شیراز، ایران
(saeedzare887@gmail.com)
(alijafari1374mazandaran@gmail.com)
خلاصه
موادهای شیمیایی از شرکتهای: سیگما-آلدریچ، مرک، یژینگ، داروسازی ژجیانگ شینفو خریداری شدهاند. مجوعه ای از پلیمرهای جدید زیست تخریب پذیر (پلی گلیسیرین آزلاییک اسید)، (پلی پلیول سباسات)، (پلی گلیسرول سباسات)، (پلی گلیسرول سباکات) که به روش فناوری سبز سنتز میگردد. خانوادهای از پلیمرهای مصنوعی زیستتخریبپذیر را توسعه دادهایم که با عنوان پلیمرهای پلی (پلیول سباسات) (PPS) از واحدهای ساختاری درونزاد برای بدن انسان تشکیلشدهاند. پلیاستر پلی (گلیسرول آزلات) (PGAz) با استفاده از روش پلیکندانسیون عاری از کاتالیست، سنتز شده است.پلی(گلیسرول سباکات) (PGS) از لحاظ کاربردهای مهندسی بافت بررسی شده است زیرا ویژگیهای زیستسازگاری مناسبی دارد.
کلمات کلیدی: سنتز، مهندسی، بافت، زیست
مقدمه
سنتز سبز، دریچهی جدید را برای ساخت تجهیزات پزشکی ترمیمی ایجاد کردهاست. همچنین بررسی و آزمون این نوع مواد ما را به دستیابی خواص بهتر آنها در مهندسی بافت کمک میکند.
روش
در حال حاضر از بیومواد زیستی به عنوان جایگزین پیوند استخوان برای درمان اختلالات استخوانی استفاده میشود. بر اساس خواص بیومکانیکی، این بیومواد برای مهندسی داربستهای زیست فعال و قابل جذب زیستی که رشد درونی بافت را افزایش میدهند، انتخاب میشوند.1 ازاینرو، بیومواد زیستی بهعنوان یک جایگزین بالقوه و کاربردی ظهور کردند که بهواسطهی آنها، چندین جنبه از کاربردهای مهندسی بافت مانند بازسازی استخوان، پوست و ریه در حال حاضر امکانپذیر هستند. بررسی خوای این پلیمر ها از طریق سنتز سبز یکی از راههای دستیابی به خواص این مواد میباشد.
مواد پلی گلیسیرین آزلاییک اسید
گلیسرول، اسید آزلاییک بهعنوان مونومرهایی برای سنتز PGAZ و نانوذرات HA با اندازهی ذرات کوچک در حدود 100 نانومتر بهعنوان عوامل تقویتکننده و زیست فعال از شرکت Aldrich Co تهیهشدهاند. تمامی این مواد شیمیایی به گونهای که تهیهشده بودند به کار گرفته شدند و هیچگونه عملیات خالصسازی اضافهای روی آنها صورت نگرفت. سالین بافر شدهی فسفات (pH ~ 7.3) از شرکت GIBCO خریداریشده است. سلولهای فیبروبلاست از مرکز تحقیقات فناوری سلولهای بنیادی (پاستور) بهدستآمده است؛ این مواد شیمیایی در یک فلاسک کشت T-75 مدل Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F-12 Ham) به همراه سروم جنین گاوی 10 درصد (v/v)، پنیسیلین و استرپتومیسین نگهداری شده است. از آب دیونیزهی دو بار مقطر در مراحل مختلف این تحقیق هم استفادهشده است.
روش سنتز
سنتز پلی گلیسیرین آزلاییک اسید
طبق مطالعات قبلی، پلیاسترهای زیستی از طریق واکنشهای پلیمریزاسیون زنجیرهای مذاب در غیاب کاتالیست و حلّال سنتز شدهاند. توضیح مختصر این مورد به اینگونه است که مقادیر هم مولار گلیسرول و آزلاییک اسید در راکتور احاطهشده با یک حمام روغن ریخته شده است. دمای حمام روغن با ترموکوپلی کنترل میشود که روی 130 درجهی سلسیوس تنظیمشده است. بعد از ذوب کردن و مخلوط کردن مواد به مدت 1 ساعت در اتمسفر N2، فشار راکتور به 100 کیلوپاسکال کاهش دادهشده است. متعاقباً، ویسکوزیتهی رزین در حین فرآیند پلیمریزاسیون افزایش دادهشده است. سپس فشار به میزان بیشتری تا 10 کیلوپاسکال برای 24 ساعت کاهش دادهشده است. پس از تکمیل واکنشها در یک زمان خاص، رزین زردرنگ با ویسکوزیتهی بالا برای تهیهی نمونهها جمعآوری شد. واکنشهای شیمیایی و تدارکات مورداستفاده، بهصورت شماتیک در شکل (1) نشان دادهشده است.
از روش پلیمریزاسیون درجا بهعنوان یک روش بدون حلال، برای آمادهسازی نمونههای نانوکامپوزیت استفادهشده است. در ابتدا، مونومرها وزن شده و یک غلظت تنظیمشده از نانوذرات به میزان 5/0، 0/1 و 5/1 درصد وزنی (بسته به وزن کلی) به راکتور اعمالشده و به ترتیب منجر به تولید PGAZH0.5، PGAZH1.0 و PGAZH1.5 شده است. از شرایط توالی قبلی که تحت آنها، PGAZ با دقت تهیهشده، استفادهشده است. سپس رزینهای پیش نانوکامپوزیتی حاصل در قالبهای سیلیکونی ریخته شده و به مدت 48 ساعت در یک اجاق خلأ در دمای 120 درجهی سلسیوس نگه داشته شده است. این پیش پلیمرها و نمونههای عملآوری شدهی آنها در کنار کدهای نمونهها در شکل (2) نشان دادهشده است.
ساختار مولکولی پیش پلیمر PGAZ با طیفسنجی تشدید مغناطیسی هستهای[1] (1H NMR) مورد ارزیابی قرارگرفته است. ابتدا این پیش پلیمر در محلول CDCL3 پس از ثبت طیف، حلشده است. سپس پیکهای مشخصه در طیف 1H NMR آن، به شکل زیر تعیینشدهاند:
1.28 (31H, m, –CH2–), 1.58 (14H, d, –CH2CH2O(CO)–), 2.31 (19H, m, –CH2O(CO)–), 3.48–3.82 (5H, m, OHCH2CHO–), 3.85 (1H, m, –OCH2CHOH), 4.1–4.31 (14H, m, –OCH2CHO–), 5.1 (1H, s, OHCH2CHO–), 5.21(1H, s, –OCH2CHO–).
از طیف سنجی تبدیل فوریهی مادونقرمز[2] (FTIR) روی پیش پلیمر PGAZ، مونومرها و نانوذرات HA با به کارگیری دستگاه Lincoln FTIR در محدودهی انتقالی 500 – 4000 cm-1 استفادهشده است. بااینحال، مشخصات پیوندهای شیمیایی در پوستههای پلیمری با مد ATR-FTIR تحلیلشده است.
مورفولوژی سطحی نمونهها و همچنین پراکندگی نانوذرات HA در ماتریس PGAZ با استفاده از میکروسکوپ اسکن الکترونی (SEM) موردمطالعه قرارگرفته است. از ابزارهای نگاشت و دستگاه Philips CM200 برای شناسایی اتمهای کلسیم (Ca) بهعنوان عنصر مرکزی در نانوذرات HA استفادهشده است. پیش از انجام تحلیل، نمونهها در نیتروژن مایع قرارگرفته و سطوح ترکخورده هم با روش رسوب بخار شیمیایی (CVD) در شرایط خلأ، با اتمهای Au پوشانیده شدهاند.
رفتار تخریب گرمایی پوستههای الاستومری با استفاده از تحلیل وزنی حرارتی (TGA, STA449F3) در یک اتمسفر نیتروژن با نرخ حرارت دهی 10 درجهی سلسیوس بر دقیقه مورد ارزیابی قرارگرفته است.
از گرماسنجی تفاضلی پویشی[3] (شرکت DSC, Q1000 TA Instruments) برای تعیین رفتار تبلوری و تغییرات دمای ذوب بهره گرفتهشده است. در این تحلیل، حدود 10 میلیگرم از نمونهها وزن شده و تحت اتمسفر نیتروژنی با نرخ گرمایش 5 درجهی سلسیوس بر دقیقه، در ظروف آلومینیومی قرار دادهشده است.
از آنالیز مکانیکی حرارتی پویا (شرکت DMTA, NETCH A500) در مد کانتیلور و در محدودهی دمایی بین 50- تا 100 درجهی سلسیوس با نرخ گرمایش 5 درجهی سلسیوس بر دقیقه استفادهشده است. علاوه بر این، یک مد چند فرکانسی (5/0، 1، 5، 20 و 50 هرتز) برای آنالیز سامانمند رفتار ویسکوالاستیک نمونهها استفادهشده است.
یک قطره آب روی سطوح صاف پوستهی پلیمری قرار دادهشده و سپس تحلیل زاویهی تماس برای این نمونهها انجامشده است. پنج تصویر (هر 30 ثانیهیک بار) در یک دورهی زمانی 2 دقیقهای گرفتهشده است. سپس میزان آبگریزی نمونهها با مشاهدهی قطرهی آب از زاویههای چپ و راست اندازهگیری شده است.
تخریب آب کافتی نمونهها از طریق غوطهوری پوستههای پلیمری (10mm×10mm×2mm) با وزن ویژه در 10 میلیلیتر محلول سالین بافر فسفات (PBS) بهعنوان محیط میزبان، تحلیلشده است. سپس نمونهها با دو pH خاص (7 و 11) در یک دمای ثابت (37 درجهی سلسیوس) مدلسازی شدهاند. پس از غوطهوری نمونهها در محلول PBS در هر زمان مشخص (در این مطالعه، یک مدتزمان 30 روزه بهعنوان زمان تخریب آبکافتی انتخابشده است)، نمونهها از PBS خارج شده و پس از شستشو آب دیونیزه (DW)، در اجاق خلأ تا اندازهای خشک شدهاند که به یک وزن ثابت برسند. درجهی تخریب آبکافتی از لحاظ از دست رفتن متن، با استفاده از معادلهی (1) بهدستآمده است.
که در آن، W0 برابر با وزن اولیهی نمونه و Wt برابر با وزن نمونهی خشک باقیمانده (پس از تخریب) در هر زمان است (t بر حسب روز).
برای تحلیل چسبندگی سلولی، نمونهها به دیسکهای دایرهای با ابعاد از پیش تعیینشده، برش دادهشده و سپس در طول شب، در محلول سالین بافر شدهی فسفاتی (PBS, pH=7.4) قرار دادهشدهاند. سپس نمونهها با نور فرابنفش به مدت 20 دقیقه استریلیزه شدهاند. از سلولهای فیبروبلاست L95 موش برای ارزیابی سازگاری زیستی نانوکامپوزیتهای PGAZ استفادهشده است.
ساختار مولکولی ماکرو مولکولهای PGAZ با طیفسنجی 1H NMR، مطابق با شکل (3A) مشخصشده است.
نتایج:
در این تحقیق، یک زیست مادهی ابتکاری پلی (گلیسرول – آزلاییک اسید) سنتز شد و نانوکامپوزیتهای آن حاوی نانوذرات HA با استفاده از یک روش پلیمریزاسیون درجای بدون حلّال، مونتاژ شدند. استفاده از فرآیند پلیمریزاسیون درجا، روش مناسبی برای تهیهی نانوکامپوزیتها است. 2
مواد و روشها پلیمرهای زیستتخریبپذیر ( پلی پلیول سباسات)
سنتز و تعیین مشخصات پلیمرهای PPS
تمامی مواد شیمیایی از شرکت سیگما-آلدریچ (سنت لوئیس، میسوری، ایالاتمتحده) خریداری شدهاند؛ مگر آنکه بهطور مجزا ذکرشده باشد. مقادیر مولی مناسبی از پلیول و مونومر سباسیک اسید در یک فلاسک ته گرد 250 میلیلیتری در دمای 150 درجهی سلسیوس تحت یک گاز بیاثر ذوب شده و به مدت 2 ساعت هم زدهشده است.
سپس مواد حاصل به مدت 2-12 ساعت در شرایط خلأ (حدود 50 میلی تور) نگهداشته شدهاند که منجر به ایجاد پیشپلیمرهای پلی (زایلیتول سباسات) (PXS) 1:1 و PXS 1:2، پلی (سوربیتول سباسات) (PSS) 1:1 و PSS 1:2، پلی (مانیتول سباسات) (PMS) 1:1 و PMS 1:2 و پلی (مالتیتول سباسات) (PMtS) 1:4 شده است (طرح 1، جدول 1).
این پیشپلیمرها با استفاده از استانداردهای پلیمر خطی برای کروماتوگرافی ژل تراوشی[4] (GPC) با استفاده از تتراهیدروفوران (THF) روی ستونهای استیراژل (سریهای HR-4، HR-3، HR-2 و HR-1، واترز، میلفورد، ماساچوست، ایالاتمتحده) برآورد شدهاند. طیفهای 1H NMR تمامی پیشپلیمرها در (CD3)2NCOD، با استفاده از طیفسنج مدل Varian Unity-300 NMR بهدستآمده است. ترکیب شیمیایی پیشپلیمرها با مقایسهی انتگرالهای سیگنالی[5] پلیول و در مقایسه با انتگرالهای سیگنالی سباسیک اسید تعیینشده است.
شدتهای سیگنالی، پیکهای –OCH2(CH(OR))nCH2O– را در 3.5-5.5 ppm از پلیول و پیکهای –COCH2CH2CH2– را در 1.3، 1.6 و 2.3 ppm از سباسیک اسید نشان داده است. پلیمرهای PPS در یک گام پلیکندانسیونی دیگر با استفاده از دمای 120-150 درجهی سلسیوس تحت خلأ (حدود 2 پاسکال) به مدت 4 روز تولیدشدهاند (برای مشاهدهی شرایط خاص عملآوری، جدول 2 را ببینید).
تحلیل طیفسنجی فروسرخ تبدیل فوریه – بازتاب کلی تضعیفشده (ATR-FTIR) روی این شبکههای پلیمری با استفاده از یک اسپکتروفتومتر مدل Nicolet Magna-IR 500 انجامشده است. قابلیت تر شوندگی پلیمرهای PPS با استفاده از اندازهگیریهای زاویهی تماس و آبپوشی این پلیمرها هم با استفاده از تفاوت جرمی، پس از 24 ساعت قرارگیری در ddH2O در دمای 37 درجهی سلسیوس تعیینشده است.
زاویهی تماس آب در هوای پوستههای پلیمری با استفاده از روش قطرهی چسبیدهی و نرمافزار تحلیل تصویر VCA2000 اندازهگیری شده است (n=10). آزمونهای کششی روی نوارهای پلیمری آبدارشدهی به شکل لقمهی استخوانی[6] (ddH2O در دمای 37 درجهی سلسیوس، به مدت بیش از 24 ساعت) روی یک Instron 5542 (طبق استاندارد D412-98a ASTM) با استفاده از یک سلول بار 50 یا 500 نیوتونی و تجهیزشده با نرمافزار Merlin صورت گرفته است.
دماهای تبدیل شیشهای (Tg) و سایر تبدیلهای بالقوهی فازی، در محدودهی دمایی از 90- تا 250 درجهی سلسیوس با نرخ گرمایش / سرمایش 10 درجهی سلسیوس بر دقیقه، با استفاده از یک Q1000 DSC تجهیزشده با نرمافزار Advantage نسخهی v2.5 (مدل TA Instruments، نیوکاسل، ایالت دلاور، ایالاتمتحده) اندازهگیری شده و سپس با استفاده از نرمافزار تحلیل Universal نسخهی v4.3A (TA Instruments) تحلیلشده است.
متغیرهای چگالی جرمی با استفاده از یک چگالی سنج (مدل Humboldt، شرکت MFG. CO) اندازهگیری شده و تراکم اتصال عرضی (n) و همچنین جرم مولکولی نصبی بین اتصالات عرضی (Mc) هم از معادلات زیر برای یک الاستومر ایدئال بهدستآمده است [16]؛ جایی که E0 نشاندهندهی مدول یانگ، R برابر با ثابت جهانی گاز، T برابر با دما و ρ هم برابر با چگالی جرمی است:
(1)
جدول 1- شرایط پلیکندانسیون، ترکیب، دماهای ذوب و توزیع وزن مولکولی پیشپلیمرهای PPS.
پیشپلیمر | تجزیه با
1H NMR |
Tma(oC) | Mw(g/mol) | Mn(g/mol) | PDI |
PXS 1:1 | 1.10:1.00 | ~80 | 2443 | 1268 | 1.9 |
PXS 1:2 | 1.08:2.00 | ~100 | 6202 | 2255 | 2.7 |
PSS 1:1 | 0.91:1.00 | ~80 | 6093 | 3987 | 1.5 |
PSS 1:2 | 0.89:2.00 | ~100 | 23013 | 8990 | 2.6 |
PMS 1:1 | 0.99:1.00 | ~100 | 3182 | 2038 | 1.6 |
PMS 1:2 | 1.06:2.00 | ~120 | 10097 | 4379 | 2.3 |
PMtS 1:4 | 1.18:4.00 | ~130 | 13265 | 2992 | 4.4 |
Tm دمایی است که تحت آن، پلیمرها از حالت مومی مات به حالت مایع شفاف ویسکوز تبدیل شدهاند. Mn: متوسط عددی وزن مولکولی. Mw متوسط وزنی وزن مولکولی. PDI: شاخص بس پاشیدگی[7] (Mn/Mw).
a: Tms دماهایی هستند که تحت آنها، پلیمر از حالت مومی سفید و مات به حالت مایع روان و شفاف تبدیل میشود.
نتایج:
پلیمرهای PPS دارای ماهیتی مصنوعی هستند اما این مزیت را دارند که از واحدهای ساختاری درونزاد نسبت به متابولیسم بدن انسان ساخته شوند. به طور بالقوه، امکان وجود مواد کامپوزیتی و کوپلیمرهای مختلفی وجود دارد که منجر به دسترسی به تعداد قابلتوجهی پلیمر از طریق طرح سنتزی ارائهشده در این مقاله میشود. پلیمرهای PPS زیست سازگاری قابل مقایسهای را با مواد تأییدشده برای استفادهی انسانی مانند PLGA، از خود نشان دادهاند.3
مواد (پلی گلیسرول سباکات)
PVA (Mw=145000، درجه هیدرولیز = 98%)، گلیسرول (خلوص 99%) و سباسیک اسید (خلوص 99%) از شرکت مرک خریداری شدند. L-گلوتامین، دیمتیل سولفوکسید (DMSO) و 3-(4.5-دیمتیل-تیازول-2-yl)2.5-دیفنیلتترازولیون برمید (MTT) از شرکت بیو ایدیا خریداری شدند. N,N-دیمتیلفرمامید (DMF) از شرکت فلوکا خریداری شد. خونابه جنین گاوبی (FBS)، RPMI-1640، خونابه اسب (HS)، آنتیبیوتیک و تریپسین-اتیلندیآمینتترااستیک اسید (EDTA) از شرکتب یوایدیا خریداری شد.
سنتز (پلی گلیسرول سباکات)
PPGS از طریق واکنش پلیچگالش با اصلاحاتی گزارش شده. مختصراً ترکیب مولار گلیسرول و سباسیک اسید 1 به 0.8 در بالن پایینگرد با دو لوله گردنی در دمای 170 درجه سانتیگراد تحت گاز نیتروژن به مدت 3، 5 و 7 ساعت واکنش داده شد. طیفسنجی فروسرخ تبدیل فوریه (FTIR) برای توصیف گروههای عاملی pPGSها بکار رفت.
پس از تعیین نمونه بهینهای pPGS سنتزشده، طیفسنجی از رزونانس مغناطیسی هستهای (1H NMR) بکار رفت تا ساختار ملکولی pPGS ساختهشده بررسی شود. در این زمینه، محلول pPGS با حل پلیمر pPGS در CDCI3 بدست آمد و سپس تحلیل شد. نرمافزار MestReNova NMR برای پردازش و تحلیل دادههای حاصل بکار رفت.
نمونه بهینهای از pPGS سنتزشده از لحاظ واکنش شیمیایی با استفاده از تحلیل انکسار اشعه ایکس توصیف شد تا بلورینگی پیش PGS پس ساز پلیمرسازی ارزیابی شود. قسمت پویشی 5-80o با تابش Cu و Ka در 40kV انتخاب شد. ویژگیهای حرارتی pPGS نیز به وسیله اندازهگیری گرماسنج پویشی تفاضلی (DSC) شناسایی شدند.
در این تحلیل ابتدا نمونهها تا دمای 200 درجه سانتیگراد حرارت داده شدند و با سرعت 10 درجه بر دقیق تحت دبی گاز نیتروژن 20mL/min سرد شدند و سپس با سرعت 10 درجه بر دقیقه تا دمای 200 درجه سانتیگراد حرارت داده شدند. دماهای ذوب (Tm)، تبلور مجدد (Tc) و تبدیل شیشهای با استفاده از دماسنجهای DSC اندازهگیری شدند.
نتایج
در این مطالعه پیشPGS در 3 ساعت به جای 24 ساعت سنتز شد که منجر به کاهش زمان سنتز و مصرف انرژی شد. داربستهای PVA-PGSالکترواسپینشده با نسبتهای مختلف (40:60, 50:50, 60:40)به صورت موفقیتآمیزی به عنوان ماده پایه برای کاربردها در مهندسی بافت عصبی ساخته شدند و نشان میدهد زیستسازگاری مناسب را داراست که بیانگر کاربرد آنها در احیاء عصب نیز است.4
نتیجه گیری
تعیین روش سنتر سبز پلیمرهای (پلی گلیسرول سباکات ، پلی پلیول سباسات، پلی گلیسیرین آزلاییک اسید) برای مهندسی پزشکی ترمیمی یکی از روش های مهم و کاربردی میباشد که در آن با بررسی خواص آنها میتوان به این نتیجهگیری رسید که قابلیت زیست سازگاری و جایگزینی مناسب برای بافتهای تخریب شده و آسیب دیده میباشند و همچنین از روش سنتز این پلیمرهای میتوان به پلیمرهای مختلفی نیز دست پیدا کرد و همچنین روشهای سنتز همچون پلیمرازیسیون درجا راه مناسبی برای تهیه نانو کامپوزیتها میباشد.
مراجع
- Baheiraei, S. Zare Jalise and S. A. Saneie. Pathobiology Research 2017 Vol. 20 Issue 2 Pages 1-22
- Hosseini Chenani, V. F. Rezaei, V. Fakhri, F. R. Wurm, L. Uzun and V. Goodarzi. Journal of Applied Polymer Science 2021 Vol. 138 Issue 24 Pages 50563
- P. Bruggeman, B.-J. de Bruin, C. J. Bettinger and R. Langer. Biomaterials 2008 Vol. 29 Issue 36 Pages 4726-4735
- Saudi, M. Rafienia, A. Zargar Kharazi, H. Salehi, A. Zarrabi and M. Karevan. Polymers for Advanced Technologies 2019 Vol. 30 Issue 6 Pages 1427-1440
[1] Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy
[2] Fourier Transform Infrared
[3] Differential scanning calorimetry
[4] Gel permeation chromatography
[5] Signal integrals
[6] Dog-bone shaped polymer strips
[7] Polydispersity Index